细胞培养视频下载

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细胞培养视频下载(一)
细胞培养技术视频文本

一．物品准备

培养室的灭菌：

1. 定期打扫培养室：每周打扫一次，先用自来水拖地，擦桌面，超净工作台等，然后用3‰的来苏或新洁尔灭擦拭。

2. 二氧化碳培养箱的灭菌：先用3‰的新洁尔灭擦拭，然后用75%酒精或0.5%过氧乙酸擦拭，用紫外灯照射。

3. 实验前打开紫外灯照射30分钟。

4. 试验后用75%酒精3‰的新洁尔灭擦拭超净工作台，边台，倒置显微镜的载物台，打开紫外灯照射30分钟。

5. 实验人员的实验准备：肥皂洗手，穿上隔离衣，戴好帽子，口罩，换上入室拖鞋。戴上手套，用75%酒精棉球擦拭双手。

无菌操作演示：

1. 凡带入超净工作台的酒精，PBS，培养基，胰蛋白酶的瓶子均要用75%的酒精擦拭瓶子外面。

2. 靠近酒精灯火焰操作。

3. 器皿使用前必须过火灭菌。

4. 继续使用的器皿（如瓶盖，滴管）要放在高处，使用时仍要过火。

5. 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻，准确，如吸管不能碰到废液缸。

6. 吸取两种以上的液体时，要注意更换吸管，防止交叉污染。

常用物品准备：

1. 玻璃吸管：实验室常用的玻璃吸管，粗的一端要用棉花盖上，防止吸液时液体进入吸头而造成污染。再将其装入吸管筒。

2. 培养皿：要用专用的器皿装好或用牛皮纸包好再进行消毒。

3. 离心管：有盖离心管要用盖子盖好。 无盖离心管要用铝箔纸盖好，防止灰尘掉入管内。放入饭盒，用报纸包好，写上日期。

4. 盐水瓶：可用铝箔纸或者牛皮纸封口，牛皮纸封口把长约20cm×宽3cm左右的牛皮纸一张反折叠1/3，包裹瓶口，用报纸包好，写上日期。

5. 将所有要消毒的物品放入烤箱，注意不耐热的和塑胶类的物品不能干烤。打开开关，调节温度至160℃，消毒两小时。温度上升到160°C时大概需要40分钟，因此要算上这部分时间。消毒完毕，关掉开关，当温度降至50度左右时方可取出物品。物品使用的有效期为7-14天。

二．细胞培养常用耗材介绍

1. 培养板：

6孔板：多用于原代培养或免疫组化等实验

12孔板：用于细胞分离培养

24孔板：用于记录细胞生长曲线

48孔板：用于流式细胞数等

96孔板：多用于NTT或克隆等实验，也可以用来测蛋白浓度

2. 培养瓶：

1）25cm²的培养瓶：注意此种培养瓶有透气盖，放入培养箱时无需松盖；另外一种培养瓶：无透气孔，放入培养箱时需要松盖半圈。

2）50cm²的培养瓶：也无透气孔，放入培养箱时需要松盖半圈。

同一型号的培养瓶，有透气盖的价格较贵。

3．培养皿：直径为35mm，60mm，90mm。盛取，分离，重离组织或测细胞毒性，集落形成，单细胞分离，同位素参入，细胞繁殖等实验使用。

4. 离心管：分别有50ml，15ml，10ml。

5. 冻存管：用于细胞和组织的冻存。

三．培养基的配制

1.滤器的准备：

（1）检查超滤装置有无裂缝，拧开上层滤器，取滤膜一张，光滑面朝上，放在滤器的滤盘上。盖好滤器，拧紧滤器。

（2）在滤器两侧的小孔塞上棉花，上盖的三个小孔也塞上棉花。

（3）一侧小孔套上接头，另一侧小孔套上小盖帽。分别用小包布包好。最后用大包布将整个滤器包裹好。

2.盐水瓶的准备

取铝箔纸封住瓶口，注意要防止灰尘落入瓶内。再用报纸或牛皮纸包好。并写上日期。

3.盐水胶塞的准备

用盒子将盐水胶塞装好，再用报纸包好，最后写上日期。

4.高压蒸汽灭菌法处理：

（1）打开电源开关，推锁，开盖。拿起载物篮，检查水位。当水位低于底部铁皮时需补加蒸馏水。

（2）放回载物篮后，把物品放入载物篮内。盖上盖子，上锁。设置温度为121度，消毒时间为20分钟。

（3）高压完毕后，待温度降至90度以下方可打开高压锅，取出物品。放入37-56度的烤箱烤干物品，消毒物品在干燥的环境下可保存2周。

5.培养基的种类

实验室常用的培养基有：

1） DMEM培养基，每盒培养基有10小包×1L。含有其他成分，如各种氨基酸，糖类及

蛋白等。黑体字特别注明，每升培养基需加碳酸氢钠克数。（3.7g）

2） RPMI 1640培养基：每盒10小包×1L。黑体字特别注明每升培养基需加碳酸氢钠2.0g。 这两种培养基广泛应用于各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养；如A9，3T6等细胞系的培养。

6.培养基的溶解：

以RPMI 1640培养基为例：

（1） 按要求称量碳酸氢钠2g，还要称取HEPES 2g 。（HEPES是一种氢离子缓冲剂，能

较长时间控制恒定的PH范围，细胞培养常用10mmol/L，对细胞无毒性作用。）分别将碳酸氢钠，HEPES，培养基倒入锥形瓶内。

（2） 先取900ml超纯水（因为最后还要定容）。往锥形瓶倒入一部分超纯水，反复将包装

袋里的培养基冲洗干净。

（3） 加入已经分装的青霉素和链霉素各10万单位。（即青霉素80万单位加超纯水4ml，

溶解后取0.5ml。链霉素100万单位加超纯水5ml溶解后取0.5ml）。

（4） 沿着瓶壁放入搅拌子，用铝箔纸封口。

（5） 把培养基放在搅拌器的磁盘上。打开电源开关，调节转速至缓慢搅拌。注意不要打

开加热开关。因为加热会导致培养基的营养成分消失。

（6） 搅拌器缓慢搅拌一小时。

7．调节PH值，定容

（1）关掉磁力搅拌器。PH计使用前先用这三种标定液表情后才可使用。用蒸馏水冲洗电极，再用吸水性强的纸擦干水分。

（2）将电极放入培养基内，按压读数键。用碳酸氢钠和稀盐酸调节培养基的PH值为7.2-7.4之间。使用完后，用蒸馏水冲洗电极。用吸水纸吸干水分。套上电极保护套，放回原位。

（3）最后定容，补加超纯水至1000ml。

8．培养基的过滤与分装。

（1）培养室及超净台用紫外线照射30分钟。

（2）在培养室内打开包布。取出滤器，打开上层盖子。倒入培养基。

（3）解开包裹接头的包布。接上负压泵。按压负压泵手柄。注意压力不能超过-15kpa。注

意观察过滤情况。如果滤液太慢，可能是培养基还未完全溶解，颗粒堵塞滤孔所致。如果太快，要注意滤膜有无穿孔。

（4）穿戴手套，用75%的酒精消毒双手。培养基接近滤完时，要及时分离负压泵，防止液

体滤干后，负压过大而把滤膜孔的微粒吸入。

（5）关超净台的紫外灯，打开抽风和日光灯。将培养基放入超净台，拧紧上层滤器盖。点

燃酒精灯。

（6）取下接头，打开另一端的包布，取下小盖帽。注意保持这边小孔无菌，因为液体要从

这边小孔倒出，用火焰烧灼镊子，取下棉花。

（7）打开报纸，用镊子取下瓶口的牛皮纸，用火焰烧灼瓶口，倒入培养基。每个盐水瓶大

概加入90ml的培养基，因为使用时还要加入10%的血清。用镊子取盐水胶塞，拿住胶塞，一边旋转一边压进去。用火焰再次烧灼边沿和瓶口外围。注意：抽滤装置的出口千万不要用火焰烧灼，否则会使其变形。

（8）最后用油性笔在盐水瓶上写上培养基的名称和日期。放入冰箱-20度保存。培养基使【细胞培养视频下载】

用前，要吸取少量培养基放在培养箱培养24h。确定没有污染后才可使用。

四．PBS的配制

（1） 配备1L的PBS需要氯化钠8g，氯化钾0.2g，12水磷酸氢二钠3.489g，磷酸二氢钾

0.2g。

（2） 将称好的试剂倒入三角烧瓶内。加入蒸馏水900ml。放入搅拌子

（3） 置搅拌器上溶解。

（4） 调节PH值。PH计使用前先用三种标定液调试。最后调节PH值在7.2-7.4之间。

（5） 定容，加蒸馏水至1000ml。

（6） 用定性滤纸过滤缓冲液，分装到盐水瓶中。注意液体不能装得太满，封口签瓶口与

胶塞之间放一条棉线，以防高压时瓶内气压将胶塞顶出。将分装后的缓冲液封好，写上名称和日期。

（7） 放入高压锅，121℃ 20min灭菌。

（8） 取出放室温冷却后放入4度冰箱保存。

五．小鼠细胞取材

骨髓间充质干细胞的原代培养：

目前常用的分离MSC的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞在

低血清培养基中有贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化及扩增MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。二者本质上无多大区别。

下面以全骨髓法为例：

1. 实验用品的准备：器械盒（内装：大剪刀一把，小剪刀2把，镊子4把，止血钳2把，

200目滤器1个），培养皿3个，培养瓶1个，5ml注射器2个，含10%FBS的培养基，PBS液，吸管，吸头，离心管，离心架，取材木板，大头针4个，白瓷缸一个（内装75%酒精）

2. 实验前将实验要用物品一一摆放在超净工作台里，照射紫外灯。

3. 在培养室的试验台上铺上报纸，放上取材板和大头钉，照射紫外灯。

4. PBS和培养基放入水浴箱中37℃预热30分钟。

实验过程：

1. 紫外灯照射培养室30分钟。关闭超净工作台紫外灯。

2. 戴上帽子和口罩。戴上手套，75%酒精洗手。

3. 在超净台内准备取材用品，在火焰旁打开PBS。烧灼瓶口和盖子，放在瓶架上。在火焰

旁边打开培养基，烧灼瓶口和盖子，放在瓶架上。

4. 取出吸管，套上吸头，过火烧灼，放入PBS和培养基内。

5. 取培养皿两个，吸取适量PBS放入培养皿内。取大剪刀一把，眼科镊两把，眼科剪一把，

止血钳两把。

6. 断颈处死小鼠，放入75%的酒精内浸泡5分钟，用大头钉固定四肢。在一侧大腿处尽量

剪大一些范围，注意避开股动脉，暴露股骨，用大剪刀在关节处剪断股骨。

7. 离体的股骨放入培养皿的PBS缓冲液中，拿到超净台里，点燃酒精灯，取两个眼科镊过

火烧灼，用眼科镊分离股骨上的肌肉。

8. 取另一个培养皿，吸取PBS，将股骨转移到另一个干净的培养皿内彻底将肌肉清楚干净。

9. 再将干净的股骨转移到另一干净培养皿内，取眼科剪，过火烧灼，将股骨两端头端剪断，

暴露骨髓腔。

10. 取培养皿一个，吸取5ml培养基放入培养皿内，将股骨放入培养基中，取5ml注射器，

去掉针头盖，吸取培养基。左手用镊子夹起股骨，右手持注射器将针头插入骨髓腔，缓慢按压注射器，将骨髓腔内的骨髓冲出，用培养基反复冲洗，直至骨髓腔内的骨髓冲净。

11. 取出离心管，过火烧灼，取出吸管，套上吸头，过火烧灼，放入离心管内。取出200目

的滤网放入一新的培养皿内。吸取含有骨髓的培养基，经目滤器过滤肌肉血块等杂物。

12. 用镊子取走滤网，取培养瓶一个，瓶口和盖子过火烧灼，吸取含骨髓的培养基入培养瓶

内。过火烧灼瓶口和盖子，盖上培养瓶。用油性笔在培养瓶上写上培养细胞名称和培养日期。

13. 收拾超净台上的物品，方可盖上盖子。

14. 在显微镜下观察细胞的密度，形态，通常一个股骨的骨髓接种一个25cm²的培养瓶，显

微镜下可见有大量悬浮细胞，主要为悬浮的红细胞。

15. 松开半圈培养瓶盖，放入37度，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。

16. 24小时候后行首次半量换液，72小时后行全量换液，漂浮的不贴壁细胞大部分随换液

除去。可见较多的贴壁细胞散在生长，分布不均，少部分呈集落性状或单个细胞存在。胞体呈长梭形，两端有长凸起，胞质内有颗粒较多，折光性差，核不清楚。在第七天时，形成明显克隆，经传代纯化的MSC细胞在形态上更趋于一致，围成纤维细胞样。

六．胰蛋白酶的配制

1.溶解：

胰蛋白酶的作用是：使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度，温度和作用时间有关。在PH为8.0，温度为37度时，胰酶溶液的作用能力最强，常用的胰蛋白酶规格为1:250。

（1）按胰蛋白酶溶液浓度为0.25%，用电子天平称取等量粉剂倒入小烧杯中。对于比较难消化的细胞，需要加入0.02%的乙二胺四乙酸二钠（EDTA），因为EDTA可以络合钙离子，增加消化效力。

（2）用量筒量PBS 100ml，倒入小烧杯内。封上铝箔纸。放入4度冰箱内过夜，或者冰浴中低速搅拌4小时。

2.调节PH值：

第二天，从冰箱取出过夜的胰蛋白酶溶液。用蒸馏水冲洗电极，吸水纸吸干。将电极放入溶液内，按压读数键，因为胰蛋白酶会使液体变为酸性，用稀氢氧化钠调节PH至8.0左右。

3.过滤与分装：

（1）培养室用紫外线照射30分钟。戴上帽子和口罩，戴上手套，75%酒精洗手。

（2）关紫外灯，开日光灯和通风机。将胰蛋白酶放入超净台。点燃酒精灯。取出离心管，拧开盖子，过火烧灼。

（3）去掉注射器的针头，抽取胰蛋白酶。打开孔径为0.22um的针头滤器，接上注射器。轻轻按压注射器，液体通过滤膜滤入离心管。过火烧灼离心管和盖子，拧紧。注意保持针头滤器的出口端无菌。用油性笔标明名称和日期。放入-20℃冰箱保存。

七．血清的分装

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成分，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能：

1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或者量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。

2.提供结合蛋白，能识别维生素，脂类，金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。

3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。

4.是细胞贴壁，铺展在塑料培养基质上所需因子来源。

5.起酸碱度缓冲液作用。

6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。

大部分血清使用前必须灭活处理，即56℃ 30分钟，灭活的目的是去除补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提出血清不灭火直接用于细胞培养。大包装的血清经过灭活后，需分装成小包装，保存在-20℃。使用前放4℃冰箱，应尽快使用。

过程：

1.培养室用紫外线灯照射30分钟。

2.关紫外灯，开日光灯和通风机。点燃酒精灯。取10ml刻度吸管，接上电动移液器。过火烧灼吸管。

3.打开血清瓶的瓶盖，过火烧灼，取离心管，过火焰烧灼，置于离心管架上。用电动移液器

细胞培养视频下载(二)
细胞培养的操作步骤

传代细胞培养的视频拍摄脚本

一、 实验准备

器材

液氮冷冻灌、 恒温培养箱、 电冰箱、高压灭菌锅、磁力搅拌器、 离心机、

分析天平、倒置显微镜、 超净工作台、弯头吸管（1个）、胶头滴管（9个）、 离心管（9个）、 带塞培养瓶（不定个）、 试管架、 量桶、 烧杯、酒精灯、 抽滤瓶、G6型号细菌过滤漏斗、带塞小玻璃瓶，大三角瓶 、无菌冻存管、液氮瓶

（一）、器皿

1玻璃器皿的清洗灭菌：

种类：小玻璃瓶、弯头吸管、滴管（3个）、培养瓶、量桶、 烧杯、抽滤瓶、大三角瓶，细菌过滤器接口管

药品：5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml

（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过

夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。

（镜头一：实验人员将器皿放进加有5％盐酸溶液的盆内，并以字幕和配音

的形式显示浸泡或煮沸时间和浸泡目的）

（2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干

（镜头二：实验人员刷洗器皿，使用正规的清洗方法，并烘干，只示范其

中2--3种即可，实验人员必须介绍操作示范烘干箱的使用方法和相关数据的设置方法）

（3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液

稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作

用，操作过程需戴防护用具。

（镜头三：带好橡胶手套将清洁液加入到盆中，让后进行酸浸，并以字幕

的形式显示浸泡时间）

（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲

洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次

将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无

油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。

（镜头四：自来水冲洗，蒸馏水清洗，烘干一起完成，在这个过程中可在

装器皿的盘中放入一定量的玻璃器皿，只对其中一种进行自来水冲洗、蒸馏水清洗，洗好后就将所有仪器放入烘干箱中烘干，并在每一个步骤中以字幕或语音的形式显示相关操作次数和时间）

（5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒

灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。

（镜头五：实验人员对实验器皿中的1—2种进行包装示范，然后将其他包

装过的器皿一起放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌）

（实验人员必须示范操作高压灭菌锅和恒温干燥箱的用法，示范操作步骤，只示范一次即可，在下面的不同灭菌温度和不同灭菌时间可以字幕的形式显示）

2、橡胶制品清洗消毒

种类：玻璃瓶橡胶塞、培养瓶瓶塞、皮管、滴管头

新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L

HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备

用 （镜头：0.5mol/L NaOH煮沸，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟各一个镜头，因为在上面已经示范过干燥箱和灭菌锅的操作方法，在使用干燥箱和高压灭菌时只需以字幕的形式显示烘干温度、灭菌温度、灭菌时间即可）

3、塑料制品的清洗消毒

种类：瓶盖、离心管

塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签

和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。

（因在器皿的准备过程中玻璃制品是最主要的，故塑料制品的清洗和消毒灭菌的方法可用字幕的方法显示出来）

（注意：各种不同材质器具的不同灭菌时间？温度设置？）

2、试剂准备

试剂 ：RPMI l640培养液, 小牛血清（生长因子）, 胰蛋白酶液，75%乙醇

（消毒）,冻存培养液（培养液7ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS缓冲液等。 重点配置的药品：RPMI l640培养液、0.2%胰蛋白酶液(typsin)。

药品：RPMI l640 培养粉、双蒸水、HEPES、碳酸氢钠、青霉素、链霉素；

typsin粉末。(HEPES氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围, 细胞培养常用

10mmol/L。10mmol/L HEPES缓冲液配制方法如下：准确称取HEPES 2.383g，加入新鲜三蒸

水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。)

器材：大三角瓶、移液枪及枪头、无菌EP管、无菌室、无菌操作台、磁力

搅拌器、G6型号细菌过滤漏斗、细菌过滤漏斗、冰箱。

（1） RPMI l640基础培养液的配制 ：

称取RPMI l640 培养粉 10.4g溶于1,000 mL双蒸水中,磁力搅拌器搅

拌40min. 加HEPES 2、4g。搅拌十分钟，2g碳酸氢钠 搅拌十分钟 。过滤

前要加双抗 加入双抗至最终浓度为 100单位/mL。过滤

经G6型号细菌过滤漏斗抽滤后备用

1、取RPMI l640培养粉10.4g，加入1L双蒸水于磁力搅拌器下搅拌40min

2、加入HEPES 2、4g，再次搅拌溶解10min，再加入2g碳酸氢钠，搅拌十

分钟（每一步一个镜头一个配音说明即可，每一步骤6s左右时间）

3、无菌实验室打开紫外灯，紫外灭菌30min（可配音说明，6s左右）

4、人工消毒准备，无菌操作台酒精擦拭灭菌

（镜头：实验人员穿上无菌实验室操作服用戴上橡胶手套，然后就位用酒

精棉球消毒试验台）

5、将灭过菌的细菌过滤器进行组装

（镜头：细菌过滤器的灭菌时间和灭菌温度可以配音或字幕的形式显示）

6、在无菌工作台上在培养基中加入双抗，并混匀，配成各100单位/ml双抗，

混合后经行细菌过滤器过滤，并示范操作

7、将灭过菌的小玻璃瓶于试验台上解封，取下封口纸，将小玻璃瓶瓶口于

酒精灯上过火，分装培养基，装好后再次过火，用过火后的橡胶塞塞紧，并编号，写上配置时间和配置人（每瓶90ml，只示范一个即可）

8、将封装好的培养液放入4℃冰箱中存放备用。

（在这几个步骤中每一步均以10s左右的视频时间演示，再加上培养，然后

切入下一个步骤）

（2）胰酶的配制： 称取适量typsin粉末配制成0.1%--0.25%的浓度（0.006gtypsin粉末+3ml 双蒸水），配制时要使用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液（如D-hank's溶液），因为这些物质都会对胰酶产生抑制作用，胰酶无菌过滤时胰酶量多不锈钢过滤，量少时用抽提过滤 。

二 、实验台准备，实验人员就位

消毒剂:操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用碘酒、酒精消毒。无菌室内

桌椅和物体的消毒可用过氧乙酸、来苏儿等擦拭或浸泡。

紫外线：主要用于消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消

毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。

（镜头：在紫外线灯照射下的超净工作台和实验室一个镜头）

三 、复苏细胞

原理：冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。

材料：冻存的Hela细胞

器材：带塞培养瓶、离心管（3只）、胶头滴管（3只）、1ml移液枪、1ml移液枪头、烧杯、酒精灯、试管架、离心机、无菌操作台、恒温培养箱

细胞培养视频下载(三)
细胞培养全过程

第一章 细胞培养的基本原理与技术

现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。

第一节 体外培养的概念

一、基本概念

体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。

●组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。

●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。

●器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。

二、体内、外细胞的差异和分化

1.差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。

2.分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。

第二节 细胞培养的一般过程

一、准备工作

准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。

二、取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

三、培养

将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。

正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。

原代培养一般有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。

四、冻存及复苏

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

五、常用仪器设备

无菌室,超净工作台,三重纯水蒸馏器,抽气泵,压力蒸气消毒器,电热恒温培养箱,培养器具，CO2培养箱,恒温水浴锅,倒置显微镜,离心机,无菌过滤器,洗刷装置,细胞计数板和电子细胞技术仪等等。

第三节 细胞培养的无菌环境

一、无菌室

无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。

无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。

此外，还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。

二、超净工作台

工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。

超净台的使用与保养：超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射10－30分钟，然后让超净台预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。

第四节 常用培养器皿及清洗消毒

细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。

一、清洗

离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。

（一）玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤。

1.浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。

2.刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。

3.浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。放取器皿要小心。

4.冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。

（二）橡胶制品清洗

新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。

（三）塑料制品的清洗

塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。

（四）包装:对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。

二、消毒和灭菌 微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因

（一）物理消毒法

1.紫外线消毒:

紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。

紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2米的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3小时，期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。

紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。

2.高温湿热灭菌:

压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。

不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。

3.高温干热消毒:

干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。

干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要*近加热装置。

烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。

4.过滤除菌：

是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜滤器除菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。

（二）化学消毒：

新洁而灭，其0.1％水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。

（三）抗生素消毒：

抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。

可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。

第二章 细胞培养液【细胞培养视频下载】

现代生物技术均通过细胞作为载体来进行，无论是基因治疗、干细胞、克隆技术都在细胞内进行的。细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。

随着动物细胞大规模培养技术的迅速发展，作为细胞培养领域中最基本的原料－细胞培养基的用量也迅速增加，被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域，如疫苗生产（人用疫苗如乙脑、狂犬、甲肝、乙肝、出血热、麻疹等，兽用疫苗如口蹄、马立克、伪狂犬等），基因药物生产（如EPO、TPA等），临床用单抗（如抗人肝癌单抗、抗人肺单抗、WT3）等。

第一节 水与平衡盐溶液

1. 培养用水:

体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。最好用龙头瓶贮存，存放时间一般不应超过2周。

细胞培养视频下载(四)
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)

细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)

一、消化与吹打

版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。

许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论：

1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。

2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你可

以尝试，准备100%的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。一些悬浮培养细胞也是如此，容易聚集，不要去尝试过几个小时就拿出来吹打成单细胞悬液（不要笑，这个是初养悬浮细胞的人常犯的错误，以为悬浮培养就是一个一个分开）。细胞只要能从基质上脱离下来，这个时候即使是成片的（比如Calu-3细胞），吹打不超过20次后（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间，或者象有的同学那样吹打1h，等待单细胞悬液出现。

3，另一个帖子里提到一个比较复杂的四步消化法，这个挺有意思，我也是第一次听说，应该是网友自己发展出来的方法，很有参考价值。但我估计这个方法可能对付少数非常怪异的细胞才需要这么复杂的程序。我目前养过的近300株细胞里面，还没遇到这么怪异的。比如Caco2其实是很好消化的细胞，不需要胰酶孵育即可，只是有点成片分布。不要以为成片分布是自己没养好，这个视细胞而定。如果和标准形态不一致，那可能是自己没消化好导致的，但如果消化方法正确，仍然成片分布，甚至完全吹打成单细胞悬液，贴壁后仍然成片分布，这是细胞的特性，是因为贴壁过程中重新聚集了。这个时候你拼了命要去让它均匀分布，你的细胞之后会对你越来越不好。

4，比较难消化的细胞（润洗方法5min还不能消化），就以colon cancer为例，比如HCT15, LS411和KM12，这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100 mm dish，一次最多加入500ul，就足够了，一般我加300ul。即使这样难消化的细胞，一般不超过5min，即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候，比如tsDC细胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙状移动。

5，常规的细胞实验（增殖，凋亡，迁移，分化之类的），受消化影响不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化的话（难消化细胞例外）。但少数实验，比如病毒包装，对细胞代数，对细胞状态

要求极高。这个时候，胰酶消化，就是润洗，都会对细胞包装病毒的能力有影响，传代次数一多，细胞包装能力就会逐渐下降（当然也有其它因素影响包装效率）。这个时候都不用胰酶消化，用一些盐溶液（不是EDTA液）即可。这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性，来使得细胞脱离基质附着表面，但不切割任何蛋白。

6，EDTA的作用。许多人不用胰酶，只用EDTA，或者用

trypsin/EDTA联合作用。这里要明白，trypsin切割ECM的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA通过螯合Ca离子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加温和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA，就是这个道理。一般不要试图延长消化时间（如果10min还消化不彻底的话），而应该想其它办法。

7，PBS洗涤。消化之前用PBS洗涤，是常见的操作，因为Serum含有抑制trypsin的蛋白。但这里面也有学问可以讲，对于一些难消化细胞，那么可以配制不含Ca，Mg离子的PBS，因为这些离子也会抑制trypsin的活性。但对于绝大部分胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化的细胞，不需要配制如此溶液。

总结下来，虽然这个帖子是关于消化的，但其实消化并不是细胞培养的关键所在（虽然很重要），关键所在是细胞来源，血清质量和水源（自己配制溶液的话）。我看到版上许多人养细胞遇到各种各样的问题，很多时候bottleneck没有找到，虽然通过其它方法有所改善，但仍然是事倍功半。因为人们往往注意自己的操作，总觉得自己没有经验，而忽视试剂，溶液尤其是细胞的质量，后者其实才是许多细胞培养实验室常见的问题。

从最基础的地方教起，一步一步详细介绍细胞培养技术，非常好的开门教程

常用设备

准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、

高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。

配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。

培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。

必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。

无菌操作

无菌室的灭菌：

定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。

CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射

实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟【细胞培养视频下载】

实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

实验人员的无菌准备：

肥皂洗手。

穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋

用75％酒精棉球擦净双手。

无菌操作的演示：

凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面

靠近酒精灯火焰操作。

器皿使用前必须过火灭菌

继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。 各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。

吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。

器械的清洗和消毒

玻璃器械洗消：

一、新的玻璃器皿的洗消：

自来水刷洗，除去灰尘。

烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。

烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。 高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。

高压消毒后烘干

二、旧的玻璃器皿的洗消：

刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。

泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。

烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，

细胞培养视频下载(五)
细胞培养资料

第一章 细胞培养的基本原理与技术

现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。

第一节 体外培养的概念

一、基本概念 体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。

●组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 ●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。

●器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。

二、体内、外细胞的差异和分化

1.差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。

2.分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。

第二节 细胞培养的一般过程

一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。

二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

三、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。 正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓

度也要定时检查。

原代培养一般有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。

四、冻存及复苏（可参阅后面有关章节）为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

五、常用仪器设备 无菌室,超净工作台,三重纯水蒸馏器,抽气泵,压力蒸气消毒器,电热恒温培养箱,培养器具，CO2培养箱,恒温水浴锅,倒置显微镜,离心机,无菌过滤器,洗刷装置,细胞计数板和电子细胞技术仪等等。

第三节 细胞培养的无菌环境

一、无菌室

无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。

无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。

此外，还应注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。

二、超净工作台

工作原理：鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。根据气流在超净工作台的流动方向不同，可将超净工作台分为侧流式、直流式和外流式三种类型。

超净台的使用与保养：超净台的平均风速保持在0.32-0.48米/秒为宜，过大、过小均不利于保持净化度；使用前最好开启超净台内紫外灯照射10－30分钟，然后让超净台预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态；使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。还要定期用福尔马林熏蒸超净台。

第四节 常用培养器皿及清洗消毒

细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，因此掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是从事细胞培养工作必须的。

一、清洗 离体条件下，有害物质直接同细胞接触，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。

（一）玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤。

1.浸泡:新的或用过的玻璃器皿要先用清水浸泡，软化和溶解附着物。新玻璃器皿使用前得先用自来水简单刷洗，然后用5％盐酸浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附有大量蛋白质和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后应立即浸入清水中备刷洗。

2.刷洗:将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂水中，用软毛刷反复刷洗。不要留死角，并防止破坏器皿表面的光洁度。将刷洗干净的玻璃器皿洗净、晾干，备浸酸。

3.浸酸:浸酸是将上述器皿浸泡到清洁液中，又称酸液，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面的可能残留物质。浸酸不应少于六小时，一般过夜或更长。放取器皿要小心。

4.冲洗:刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗的干净，直接影响到细胞培养的成败。手工洗涤浸酸后的器皿，每件器皿至少要反复“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包装备用。

（二）橡胶制品清洗

新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。

（三）塑料制品的清洗

塑料制品特点：质软、易出现划痕；耐腐蚀能力强、但不耐热。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。

（四）包装:对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料：牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装，非常方便，适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。

二、消毒和灭菌 微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因

（一）物理消毒法

1.紫外线消毒:紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。革兰阴性菌最为敏感，其次是阳性菌，再次为芽孢，真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。直接照射培养室消毒，用法简单，效果好。

紫外灯的消毒效果同紫外灯的辐射强度和照射剂量呈正相关，辐射强度随灯距离增加而降低，照射剂量和照射时间呈正比。因此紫外灯同被照射物的距离和照射时间要适合。离地面2米的30W灯可照射9平方米房间，每天照射2－3小时，期间可间隔30分钟。灯管离地面2米以外要延长照射时间，2.5米照射效果较差。紫外灯照射工作台的距离不应超过1.5米，照射时间30分钟为宜。

紫外灯不仅对皮肤、眼睛伤害，且对培养细胞与试剂等也产生不良影响，因此，不要开着紫外等操作。

2.高温湿热灭菌:压力蒸汽灭菌是最常用的高温湿热灭菌方法。对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、璃器皿、属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。

不同压力蒸汽所达到的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。煮沸消毒也是常用的湿热消毒方法，它具有条件简单、使用方便等特点。

3.高温干热消毒:干热灭菌主要是将电热烤箱内物品加热到160℃以上，并保持90－120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂）。

干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后在打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。干烤箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。

烧灼也是灭菌方法之一，常利用台面上的酒精灯的火焰对金属器皿及玻璃器皿口缘进行烧灼消毒。

4.过滤除菌：是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到

除菌目的。在体外培养时，过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液。目前，大多实验室采用微孔滤膜器除滤菌。关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。

（二）化学消毒：新洁而灭，其0.1％水溶液可对器械、皮肤、操作表面进行擦拭和浸泡消毒。

（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不严重时的“急救”方法。不同抗生素杀灭微生物不同，应根据需要选择。

可用于细胞培养的消毒灭菌方法很多，但每种方法都有一定的适应范围。如常用的过滤除菌系统、紫外照射、电子杀菌灯、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒实验室空气；多用新洁而灭消毒实验室地面；常用干热、湿热消毒剂浸泡、紫外照射等方法消毒培养用器皿；采用高压蒸汽灭菌或过滤除菌方法消毒培养液。

第二章 细胞培养液

现代生物技术均通过细胞作为载体来进行，无论是基因治疗、干细胞、克隆技术都在细胞内进行的。细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。细胞培养基其组成成分主要有：水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子及其他一些入核酸降解物、激素等。

随着动物细胞大规模培养技术的迅速发展，作为细胞培养领域中最基本的原料－细胞培养基的用量也迅速增加，被广泛应用于细胞生物学科和医学研究的各个领域，如疫苗生产（人用疫苗如乙脑、狂犬、甲肝、乙肝、出血热、麻疹等，兽用疫苗如口蹄、马立克、伪狂犬等），基因药物生产（如EPO、TPA等），临床用单抗（如抗人肝癌单抗、抗人肺单抗、WT3）等。

第一节 水与平衡盐溶液

1.培养用水:体外培养的细胞对水质特别敏感，对水的纯度要求较高。培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。用金属蒸馏器制备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。配制培养用液应使用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。最好用龙头瓶贮存，存放时间一般不应超过2周。

2.缓冲溶液、生理盐水、平衡盐溶液：稍后介绍。

第二节 细胞培养基的基本要求

体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。

一、营养成分 维持细胞生长的营养条件一般包括以下几个方面：

1.氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。所有细胞都需要12种必须氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源，同样也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基本物质。 体外培养的各种培养基内都含有必需氨基酸。

2.单糖：培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。细胞对葡萄糖的吸收能力最高，半乳糖最低。

体外培养动物细胞时，几乎所有的培养基或培养液中都以葡萄糖作为必含的能源物质。

3.维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。

4.无机离子与微量元素：细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。

二、促生长因子及激素 已证实：各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的作用。有些激素对许多细胞生长有促生长作用，如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。有些激素对某一类细胞有明显促进作用，如氢化可的松可促进表皮细胞的生长，泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。

三、渗透压 细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260－320mOsm/kg的范围都适宜。

四、pH 气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体丰要是氧和二氧化碳。氧参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种成分。一些细胞在缺氧情况下，借糖酵解也可获取能量，但多数细胞缺氧不能生存。在开放培养时，一般置细胞于95％空气加5％二氧化碳的混合气体环境中培养。二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它主要与维持培养基的pH有直接关系。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值约在7．2~7．4℃在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，PH值发生变化。由于NaHCO3容易分解为二氧化碳，很不稳定，致使缓冲系统难以精确地控制。故这一缓冲系统适合密闭培养。HEPES结合碳酸氢钠使用，可提供更有效的缓冲体系，主要是防止pH值迅速变动，但最大缺点是在开放培养或观察时难以维持正常的pH值。造成pH波动主要是代谢产生的CO2，在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，培养基pH很快下降。为解决这一问题，合成培养基中使用了NaHCO3-CO2缓冲系统，并采用开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出培养瓶，再通过稳定调节温箱中CO2浓度（5％），与培养基中的NaHCO3处于平衡状态。

五、无毒、无污染 体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。

第三节 天然细胞培养基

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。

一、血清(serum)细胞培养的发展，培养基的质量又是关键，而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的，所以血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。

1.血清种类:目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。显然，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。

2.血清的主要成分:血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无

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